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总蛋白测定

2016-12-06  编辑: xinli
项目概述

血液中除去血细胞等有形成分的部分称为血浆。血浆中含有多种蛋白质,将血浆内蛋白质总量称为血浆/血清总蛋自(total protein, TP)。TP是血浆中最主耍的固体成分,它们占血浆质量的7%-8%,因此,血浆是高浓度的蛋白质溶液。血浆蛋白在完成各种生理功能中起着关键的作用,包括血浆胶体渗透压的维持、血浆pH和酸碱平衡的调节、凝血和抗凝血功能、免疫作用、感染防御和物质运输等。血浆蛋白质的多样性,是生物体内具有广泛而重要的生理功能的基础。

根据分离方法的不同,血浆蛋白可以分离出多种不同的种类。最初采用盐析法将血浆总蛋白分为清蛋白(也称为白蛋白)和球蛋自,这是目前常用的血浆蛋白质的总分类方法。在此基础上,采用醋酸纤维素膜电泳法可将血浆总蛋白分为清蛋白、a1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和y-球蛋白 5个区带,是目前临床上较多采用的分类方法,其中除γ-球蛋白外,其余组分蛋白质均在肝脏合成,具体种类、参考范围及生物性活性见表5-1。 随分离技术的不断提高,血浆蛋白的分离组分更为精细,如采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法可将血浆蛋白分为30多条I区带,而等电聚焦电泳与聚丙烯酰胺电泳组合的双向电泳可将血浆蛋白分成100多种。目前,血浆蛋白已分离纯化的有200多种。


表5-1 血浆蛋白各组分的名称、参考范围及生物性活性(丛玉隆,2009)



按照血浆蛋自的不同功能进行分类,可分为以下几种:①参与物质运输的蛋白质,如清蛋白、脂蛋白、触珠蛋白、转铁蛋白等;②参与免疫系统和补体系统的蛋白质,如免疫球蛋白、各种补体; ③参与血液凝固系统和纤溶系统的蛋白质,如纤维蛋白原、凝血酶原、纤维蛋白溶解系统等;④与炎症相关的蛋白质,如激肽类、激肽释放酶原等。

临床应用

血清总蛋白主要为清蛋白与球蛋白的总和,其中90%以上的血清蛋白和100%的清蛋白100%是由肝脏合成的,因此,因此,血清蛋白检测有助于了解肝脏合成蛋白质的功能,对肝脏疾病的诊断和判断预后具有重要的参考价值。影响血浆总蛋白水平的因素主要包括:①肝脏疾病时,随肝实质细胞损伤,蛋白质合成减少,特别是清蛋白合成减少;②肝脏疾病时,肝内单核-吞噬细胞系统受到免疫刺激的作用,y-球蛋白生成增加;③肝脏代偿能力很强,疾病早期或损伤较轻时,总蛋白变化不明显。因此,肝脏病变往往达到一定程度和一 定病程后才能出现血清总蛋白的改变,临床上往往表现为血清总蛋白减低与清蛋白减少平行,总蛋白升高常同时伴有球蛋白升高。

(一)血清总蛋白水平升高

1. 血清总蛋白及清蛋白增高 主要由于血清水分减少、使得单位容积总蛋白浓度增加,而全身总蛋白并未增加,如急性失水、肾上腺皮质功能减退等。

2. 血清总蛋白及球蛋白增加 当血清总蛋 > 80g/L或球蛋白> 35g/L时,称为高蛋白血症。总蛋白增高主要是球蛋白增加,其中又以y-球蛋白增高为主,常见病因有: ①慢性肝脏疾病,包括自身免疫性慢性肝炎、慢性活动性肝炎、肝硬化、慢性洒精性肝病、原发性胆汁性肝硬化等,球蛋白增高程度与肝脏疾病严重程度相关;②M蛋白血症.如多发性骨髓瘤、淋巴瘤、原发性巨球蛋白血症等;③自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮、风湿热、类风湿关节炎等;④慢性炎症与慢性感染,如结核病、疟疾、黑热病、麻风病及慢性血吸虫病等。

(二)血清总蛋白水平降低

l. 血清总蛋白及清蛋白减低 血清总蛋 < 60g/L或清蛋白< 25g/L称为低蛋白血症,临床上常出现严重水肿及胸、腹水。常见病因有: ①肝细胞损害影响总蛋白与清蛋白合成,如亚急性重症肝炎,慢性中度以上持续性肝炎、肝硬化 肝癌等,清蛋白含量与有肝功能的肝细胞数量成正比,清蛋白持续下降,提示肝细胞坏死进行性加重,预后不良;②营养不良,如蛋白质摄入不足或消化吸收不良;③蛋白丢失过多,如肾病综合征、蛋白丢失性肠炎、严重烧伤、急性大失血等: ④消耗增加,如重症结核、甲状腺功能亢进及­恶性肿瘤等;⑤血清水分增加,如水钠潴留或静脉补充过多的晶体溶液,较少见有先天性低清蛋白血症。

2. 血清总蛋白及球蛋白降低 主要是球萤白合成减少,见于:①生理性减少,小于3岁的婴幼儿。②免疫功能抑制,如长期应用肾上腺皮质激索或免疫抑制剂;③先天性低y-球蛋白血症。

测定方法

血清总蛋白作为临床常用的生化实验项目,其检测方法的研究已有近百年的历史。常见的蛋白质检测方法包括凯氏定氮法、双缩脲比色法 、染料结合法(如考马斯亮蓝法)、酚试剂比色法、 紫外分光光度法和比浊法,每种方法都有其各自优势和局限性。

(一)凯氏定氮法

凯氏定氮法是经典的蛋白质测定方法.通过测定化合物或混合物中总氮量.根据蛋白质平均含氮量为16%来计算蛋白质浓度.即在有催化剂的条件下.用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐,然后在碱性条件下将铵盐转化为氨,随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收.再以标准盐酸滴定,就可计算出样品中的氮量。虽然凯氏定氮法操作复杂,不适合常规检测、但此法仍然是建立各个具体方法时采用的参考标准方法。

(二)双缩脲比色法

该方法测定血消总蛋白已有80多年历史,至今仍是临床实验室占主导地位的血清总蛋自测定方法。 该法有多种配方,Doumas于1975年提出的配方是世界卫生组织(WHO)和国际临床化学联合会(IFCC)目前推荐的方法。该方法的检测原理主要是蛋白质分子中的肽键(至少含2个肽键)在碱性条件下与二价铜离千(Cu2+)作用生成紫色的化合物,在 540mn处复合物的吸光度与样本中蛋白质浓度成正比,因此反应与两分子尿素缩合后的产物双缩脲和碱性铜溶液作用形成紫红色的反应相似,故称双缩脲反应。其反应方程式如下: 蛋白质+铜离子=紫红复合物

该方法操作简单,重复性好,干扰物质少, 重复性好,在10~120g/L浓度范围内都有良好的线性关系,但灵敏度较低

(三)染料结合法

染料结合法原理是蛋白质可与某些染抖特异性结合,如考马斯亮监、氨基黑等。例如.考马斯亮蓝法的检测原理是考马斯亮蓝在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm; 当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm沪 长下有最大光吸收峰,共反应方程式如下:

蛋白质+考马斯亮监中度酸H缓冲i也蛋白版-色索复合物

考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中,考 马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应-, 分迅 速常用来作为蛋白原含品的测定。考马斯梵蓝 R250与蛋臼质反应虽然比较缓慢,们是可以被洗 脱下去,所以可以用来对电泳条带染色。

蛋们质与考乃斯亮监G250结合在2min左小 的时间内达到平衡,共中球蛋白结合力仅为白蛋 白的70°10左右,其结合物在室温Flh内保持艳定。 该法是1976年Bradford洼止的,试剂配制简单 操作简便快捷.反应非常灵敏 闭定蛋白质浓度 范围为0 , .. __ I OOO~tg/ml, 呆小可测2.5µg ml蛋白原.

是一种常用的微堡蛋白质快速测定方认,适用于 尿液和脑脊液中总蛋自的定址。

(四)酚试剂比色法

酚试剂比色法的拟坪是基于蛋自分子中含有 酪氨酸和色氨酸残基,在碱性条件下,使酚试剂 中的磷钙酸-磷铝酸试剂还原成蓝色(生成铝蓝 和铭蓝化合物),产生的蓝色物质可在500run处 测定,从而进行总蛋白定益。其反应方程式如下:

蛋白阮+酚试剂 碱性溶液,.钜蓝和铭监化合物

酚试剂比色法出于各种蛋白质分子中上述两 种氨基酸的组成比例不同,特别是白蛋1'1含色氨 酸为0.2%, 而y-球蛋白中含堡达2%- 3%, 导 致较人的差异。Lowry的改良法存酚试剂中加入 Cu2 , 栠中还原法和双缩脉反肘两者的作用,使 呈色灵敏度提高,其中75%的呈色依赖于Cu2'o 反应产物最住吸收峰在650~750nm, 方法灵敏 度为双缩脤比色法的100倍左右,有利下检测较 微散的蛋白质。但试剂反应仍易受多种化合物的 干扰v

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