Nature:深度解读,CRISPR-Cas系统具有适应性能力的具体机制

2020-02-25 编辑: 来源: BioWorld 作者:nagisha
CRISPR技术是基于原核生物及古核生物的免疫防御系统发展而来,这种适应性的针对噬菌体等病毒的免疫防御系统存在于几乎所有的古核生物及半数原核生物中。

CRISPR-Cas系统可以摄取入侵病毒的DNA片段,并将其插入到自身的间隔序列中,新的间隔序列转录的gRNA引导Cas蛋白特异性切割与之互补的DNA序列,从而对该病毒产生适应性免疫能力。

然而,CRISPR-Cas系统的摄取和整合外源DNA的具体过程却一直不甚清楚。

近日,荷兰代尔夫特理工大学的研究人员在国际顶尖学术期刊Nature杂志上发表了一篇有关CRISPR-Cas系统适应性免疫产生机制的论文——Selective loading and processing of prespacers for precise CRISPR adaptation。

该研究证实了前间隔序列的选择、不对称修剪和定向整合的具体过程,为深入了解功能性间隔序列在CRISPR位点整合的机制提供了依据。


 
前间隔序列(pre-spacer DNA)的获取是CRISPR-Cas系统产生适应性免疫能力的过程的第一步,已有研究表明Cas1(4)-Cas(2)形成的异六聚体在其中可能起着重要作用,然而Cas1-Cas2复合物如何识别捕获合适的ssDNA(含PAM序列)仍尚未清楚。

Cas1-Cas2复合物选择前间隔序列

为了在高时空分辨率下观察前间隔序列的获取过程,研究者采用了一种单分子福斯特共振能量转移技术(smFRET)。简而言之,将带有生物素标签的Cas1-Cas2复合物通过生物素-链霉素亲和作用固定起来,前体间隔序列通过供体(Cy3)和受体(Cy5)标记。

研究者评估了Cas1-Cas2复合物与典型前间隔序列(PS-5-nt)结合的性质,值得注意的是,大多数情况下(>99%)仅为短暂的相互作用。研究者还测试了一系列长度超过5nt(7、10和15nt)的3’端突起,分析表明结合频率(kon)随着长度的增加而增大,饱和长度为>40nt,但平均停留时间(τoff)保持不变。
紧接着,研究者通过单分子分析技术研究Cas1-Cas2复合物是否在短时相互作用期间识别PAM序列。研究人员发现当3'端突起中的PAM学列偏离最佳位置时,相互作用会减弱,这一发现与之前的研究结果一致,即Cas1b富含脯氨酸C末端的Q287和I291分别在PAM序列的5 '-C+5T+6T+7-3 '区域识别C和T。

研究者设计了不同PAM变体的前间隔序列,发现Cas1-Cas2复合物对含5'-CTT-3' PAM的前间隔序列的结合频率最高,表明Cas1-Cas2复合物预先结合这一类前间隔序列。值得注意的是,这一偏好性在Cas1-Cas2复合物C末端突变体(Q287A / I291G)中不复存在。

Cas1-Cas2促进ssDNA配对

有研究表明Cas1-Cas2复合物重新利用了RecBCD和Cas3的单链DNA降解产物。于是Sungchul Kim等人通过一系列ssDNA片段重复了单分子分析,从而验证Cas1-Cas2复合物是否捕获了两个互补的ssDNA以形成一个效应整合复合物。

虽然结合事件取决于PAM序列的存在,但结合频率和解离频率并不会随着ssDNA片段中PAM位点数量的增加而改变,相比之下,结合频率取决于侧链的长度。这些发现表明Cas1-Cas2复合物可能利用一种便捷的扩散机制来定位ssDNA上的PAM序列。

前间隔序列需要以双链形式整合到CRISPR的间隔区中,研究者通过Cy5标记PAM包含链和Cy3标记PAM缺失链。他们发现在Cas1-Cas2复合物存在的情况下,两条互补链迅速互补结合,若缺乏Cas1-Cas2复合物,则检测不到两者结合发出的荧光。此外,含PAM的ssDNA展现出更高的结合亲和力。
这一结果证明Cas1-Cas2复合物促进了互补的ssDNA片段配对结合为前间隔序列,而PAM序列充当了识别标记。

前间隔序列的不对称修剪增强整合过程的定向性

若Cas1-Cas2复合物选择了具有较长3'端突起的含PAM的前间隔序列,则需将其3'端突起加工为5nt大小,以便有效整合至CRISPR基因座。之前有研究表明Cas1-Cas2复合物的Cas1具有潜在的内切核酸酶活性,可完成这一过程,但Sungchul Kim等人却没能复现这一实验,取而代之,他们测试了多种核酸酶,结果发现仅DNA PoⅢ和ExoT(两者均含有DnaQ)能完整修剪(28nt,能整合),而其他核酸酶均为部分修剪(约32nt,不能整合)。
上述的研究数据表明Cas1的C末端对识别PAM序列至关重要,同时研究者也发现这一识别作用可以有效保护前间隔序列的3'端突起,从而导致加工过程的不对称修剪。研究人员测试了不对称修剪是否会影响间隔序列的定向整合,他们发现对称修剪的前间隔序列在整合过程中没有偏向性,而非对称修剪的前间隔序列在S位和L位的整合有偏向性。

此外,作者还通过设计对称修剪、不对称修剪和不修剪的三种前间隔序列与Cas1-Cas2复合物、Cas1-Cas2复合物C末端突变体(Q287A/I291G)进行体外修剪驱动整合试验,证实了前间隔序列的不对称修剪有利于在CRISPR位点中的定向整合过程。
总而言之,这项研究更清晰地描绘了CRISPR-Cas系统适应性产生的具体过程,包括前间隔序列的选择、不对称修剪和定向整合等过程,为开发新型CRISPR技术工具提供了理论依据!
论文链接:

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2018-1




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