EASL2020:使用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向乙肝病毒

2020-10-15 编辑: 来源:医诺医学 作者:略晓薛
目前的研究认为,慢性乙肝病毒感染之所以能够持续存在,主要是因为缺乏有效的针对稳定HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)微染色体的新型治疗方法。法国里昂癌症研究中心(Cancer Research Center of Lyon,CRCL)研究人员进行了一项采用CRISPR/Cas9方法来靶向HBV基因组的研究,并研究了CRISPR/Cas9基因编辑后cccDNA的走向。

研究人员首先在表达HBV受体钠离子牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)的HepG2细胞中建立了一种核糖核蛋白(RNP)递送系统。其次,在建立感染后将核糖核蛋白(RNP)复合体进行递送,旨在确保cccDNA的靶向性。最后,在进行CRISPR/Cas9基因编辑后研究人员对细胞内外HBV参数进行分析。使用Southern印迹分析确定 cccDNA的表达,使用RNA测序以确定突变的cccDNA是否具有转录活性。

研究结果显示,通过对不同的HBV特异性gRNA的筛查发现,无论是单一的还是组合的,都表明CRISPR/Cas9可以有效地影响HBV的复制。根据HBV基因组中的靶点,CRISPR/CAS9 可使总 HBV DNA 降低或发生突变,两者都导致病毒转录本的减少。

除了cccDNA数量出现轻微减少,这种减少可能是由于降解的原因导致,研究人员持续观察到一个较小的 ccccDNA 片段的出现,通过PCR,Southern blot 和 RNA-seq 分析表明该片段在转录上是具有活性的。

这项研究结果表明,这个“小cccDNA”是Cas9同时在两个靶位点诱导双链断裂,然后修复大片段时产生的产物。

通过核苷类似物(NAs)抑制 HBV DNA 复制的中间产物后,加入核糖核蛋白(RNP)复合体出现了cccDNA水平降低,这表明cccDNA确实是 CRISPR/Cas9复合物的直接靶点。

综上所述,该项研究结果提示,用CRISPR/Cas9靶向乙型肝炎病毒会导致 cccDNA 的突变、裂解和修复,并且核苷类似物(NAs)和CRISPR/Cas9基因编辑两者合用具有有效的协同作用。

值得注意的是,Cas9诱导的效应是可持续的,表明乙肝病毒基因组发生了永久性的变化。

尽管gRNAs组合可引起截断,“小cccDNA”仍是具有转录活性的,并且有可能产生HBsAg。研究人员也表示,尽管看到上述结果,但仍有必要进行进一步和更长期的体内研究,以确定基因编辑的有效性和不可逆性。(更多肝病新药研究信息敬请关注“肝脏时间”微信公众号)!

SAT376

Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9 approach





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