新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸实验室检测要点

2020-03-18 编辑: 来源:中华医学会检验学分会
单位:空军军医大学第一附属医院检验科
作者:刁艳君
编辑:杨柳、苏明权
审核:刘家云
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邮编:710032

资料整理:空军军医大学西京医院检验科临床分子诊断实验室

2020庚子之春,突如其来的新冠病毒疫情,又一次将PCR推在疫情防控的前沿,使核酸检测成为热搜。那么,什么是核酸检测?它在新冠肺炎的诊断中起什么作用?如何发挥作用?如何在检测中保护检测人员安全、避免交叉传染和二次污染?为了帮助更多人了解这个熟悉而陌生的名字,带着诸多问题,让我们从实验室角度走近2019-nCoV核酸检测。

一、新冠病毒核酸检测的原理?

2019新冠病毒是一种RNA病毒,即遗传物质是RNA(核糖核酸)。病毒由RNA和蛋白构成,最外一层由脂质和糖蛋白组成包膜外衣,里面蛋白衣壳将RNA包裹在其中,从而使容易降解RNA得到保护。病毒通过特定细胞表面的受体入侵细胞造成感染,并利用宿主细胞进行复制增殖。病毒核酸检测的原理就是通过细胞裂解液,让病毒的RNA裸露出来,然后用实时荧光RT-PCR进行检测。检测原理最关键的是利用引物和探针来实现核酸序列的“靶向匹配”,即寻找新冠病毒约3万个碱基中区别于其他病毒的核酸序列(与其他病毒核酸相似度“低”的区域),设计引物和探针。因为引物和探针与新冠病毒核酸特定区域高度匹配,即特异性很强,一但待检标本PCR扩增结果为阳性,则证明该标本中存在新冠病毒。



图1 新冠病毒结构示意图

图2 新冠病毒核酸测定(实时荧光RT-PCR方法)的步骤

二、核酸检测对于新冠病毒感染诊断的意义?

依据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版)》确诊病例要求,临床诊断病例或疑似病例,具备以下病原学证据之一者:1.呼吸道标本或血液标本实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸为阳性;2.呼吸道标本或血液标本病毒基因测序,与已知的新型冠状病毒高度同源。因此,新冠病毒核酸检测(RT-PCR方法)是确诊感染的“金标准”之一,这个“金标准”是指“阳性”结果而言,即扩增阳性可以作为确诊新冠肺炎的依据。但另一方面,如果检测结果为“阴性”,不能作为判断患者未被感染的标准。根据钟南山院士发布的近1100例新冠肺炎患者临床数据显示,在入院接受CT检查时,76.4%的患者呈现了肺炎表现,主要为毛玻璃样阴影(50%)和双肺斑片状阴影(46.4%),绝大多数重症患者都能以此确诊。而根据此前专家表态“确诊患者中,核酸检测的阳性率约仅为30-50%”来看,新冠患者核酸检测假阴性的比例并不低。因此核酸检测不能作为确诊感染的唯一手段,数据显示如果把CT检查、核酸试剂盒和临床症状结合在一起,确诊的准确率可以达到97%。

三、临床实验室进行新冠病毒核酸检测的条件和要求?

核酸检测实验室能够进行2019-nCoV核酸检测需要符合(国家卫生健康委办公厅关于医疗机构开展新型冠状病毒核酸检测有关要求的通知(国卫办医函[2020]53号)的要求,达到二级以上实验室生物安全防护及三级个人生物安全防护规范并经卫生行政相关部门批准,方可开展。PCR实验室负压环境最为理想,注意压力监测,保持空气流动,排除气溶胶。核酸检测人员必须具备相应资质,接受2019-nCoV相关培训并考核合格。实验室应严格管理,有效门禁,分区到位,严格禁止无关人员进入。清洁区保持通风,消毒到位。相关物品分区放置,洁污分离,按时更换,洗消到位。常规消毒:较大面积以含氯消毒液为主,小面积可以用75%酒精。处理气溶胶的良好方式是开窗通风,也可以空气消毒(如紫外、过滤、空气消毒机方式)。


图3 核酸检测实验室个人三级生物安全防护示意图

四、新冠病毒核酸检测与分析流程?

核酸检测三大步骤的具体要求如下:

1.分析前----标本采集:在最新版的新冠肺炎诊疗方案中(第六版),其确诊所提到的样本类型包含了呼吸道样本、血液样本、粪便样本等。在标本选择上,首选为下呼吸道样本(如深部痰液、灌洗液等),次选为上呼吸道样本(如鼻咽拭子等),再次选为血液样本、粪便样本等。标本采集由专科(如:呼吸科、发热门诊等)临床医生或护士在个人三级生物安全防护条件下进行。标本转运:标本装入密封袋,密封袋置于标本盒,注意保持直立不倒,标本盒封闭前消毒。标本盒置于标本转运箱,转运箱封闭前,须紫外或喷雾消毒。新冠标本转运箱要有统一特殊标识。建议医疗机构内部转运时,标本采集之后立即运抵实验室,不超过2h。新冠病毒标本要单独专人转运,不要和其他物品混杂。如标本外送应用专门的二级标本转运容器运送,且在个人二级生物安全防护条件下运送。标本接收:从密封袋取出标本后,须紫外或75%酒精喷雾消毒。新冠标本属于高风险标本,建议采集、转运、接收环节有签字,以便回溯。操作者须二级生物安全防护。

样本采集环节中咽拭子取样有哪些注意细节?新冠核酸检测最常用的标本为咽拭子,方法为用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁,将拭子头浸入含3ml采样液的管中,尾部弃去,旋紧管盖。对于新冠病毒,核酸扩增试验时的处理、抽提、扩增为高风险,因此扩增前需要对标本先行灭活病毒,包括60~65℃孵育20~30min,或者用试剂盒自带的采样液灭活病毒。以核酸提取裂解液为基础配制的病毒采样液,主要成分为平衡盐类、EDTA螯合剂、胍盐(如异硫氰酸胍、盐酸胍等)、阴离子表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)、阳离子表面活性剂(如十四烷基三甲基草酸铵)、苯酚、8-羟基喹啉、二硫苏糖醇(DTT)、蛋白酶K等几种或多种组分。这种病毒保存液一方面直接裂解病毒释放核酸,消除核酸分解酶(RNase)以防止病毒的RNA降解。另外一方面,又要让病毒的蛋白变性,失去活性而“死掉”,不再有传染性,提高运输和检测阶段的安全性。



图4 咽拭子采样流程图

2.分析中----分析中实验操作需在实验室二级生物安全防护条件下进行。标本处理:标本处理整个过程应在生物安全柜内进行,生物安全柜内应配备吸水棉、消毒酒精,有条件时可配备吸水台布,以防样本外撒时应急处理,打开样本密封袋或二级容器,用75%酒精消毒外样本表面,检查样本是否密闭性后,然后取出样本袋,进行标本灭活处理后,再进行标本离心,标本离心时,开启通风设施,操作者尽可能在生物安全柜中将离心管放入和取出转子。标本离心无意外,离心停止10 min以上,开离心机盖喷雾消毒。标本检测:新冠病毒核酸检测需要二名工作人员进行核酸提取或加样操作。新冠病毒标本核酸扩增试验时的处理、抽提、扩增均为是高风险过程,个人须三级生物安全防护、全排式生物安全柜内操作。

新冠病毒核酸测定(实时荧光RT-PCR方法)的关键参数?自国家药品监督管理局启动《医疗器械应急审批程序》以来,诸多核酸检测试剂盒“蜂拥而出”。据不完全统计,国内目前有近百家企业表示已成功研发新冠病毒检测试剂盒,可供临床新冠病毒核酸检测。截至2020年3月6日,国家药品监督管理局共批准新冠病毒核酸检测试剂共10个,其中荧光PCR法8个(详见国家药品监督管理局官网)。目前批准产品均基于新冠病毒基因组中开放读码框1a/b(open reading frame 1ab,ORF1ab)、包膜蛋白(Envelope protein,E)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)进行选择。不同产品的检测原理基本一致,但是其引物、探针设计存在不同,有单靶区段(ORF1ab)、双靶区段(ORF1ab、N或E)、三靶区段(ORF1ab、N和E)的检测和判读差别,建议使用者应严格按照不同企业说明书规定的判读方式进行判读。目前,根据《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第四版)》推荐选用针对新型冠状病毒的ORF1ab和N基因区域的引物和探针,并给出了引物序列。

靶标一(ORF1ab基因):

正向引物(F):CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

反向引物(R):ACGATTGTGCATCAGCTGA

荧光探针(P):5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'

靶标二(N基因):

正向引物(F):GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

反向引物(R):CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

荧光探针(P):5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'

核酸提取和实时荧光RT-PCR反应体系参考相关厂家试剂盒说明。



图5 新冠病毒扩增子靶标在基因组上的定位

3.分析后----报告发放:检验报告建议有特殊标识,建议无纸化办公。发回隔离区的检验报告单,除非经过有效消毒,不宜出隔离区。检测后的消毒处理:检测完成后,工作人员应立即用75%酒精消毒处理外层手套,脱掉外层手套,放置生物安全柜内的垃圾桶中。检测完成后生物安全柜用0.5-1%有效氯消毒剂或75%酒精擦拭工作台面及地面。将安全柜内产生的医疗垃圾装入三层垃圾袋密封内,放入指定的垃圾桶中,垃圾袋上需标记医疗垃圾信息。生物安全柜和整个实验室空间均需紫外线消毒,至少30min。工作人员由他人协助用75%酒精对一次性外隔离衣进行消毒处理,脱去隔离衣并放入新冠检测医用垃圾指定的垃圾桶中。工作人员在离开二级实验室后,应在缓冲区脱去脱去二级防护用品,首先戴新手套,摘护目镜并放入75%酒精中浸泡消毒;脱一次性防护服,自上而下,由内向外,反转脱一次性防护服,脱一次性手套,摘N95一次性口罩,摘一次性帽子,脱一次性鞋套,脱手套。所有实验室垃圾均需高压灭菌处理后,按普通医用垃圾处理。

五、新冠病毒核酸测定(qRT-PCR法)如何进行结果判读?

依据《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第四版)》提供的引物及扩增参数,基因扩增结果判断如下。阴性:无Ct值或Ct≥40。阳性:Ct值<37,可报告为阳性。灰度区:Ct值在37-40之间,建议重复实验,若重做结果Ct值<40,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性。依据《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第五版)》在实验室要确认一个病例为新冠病毒核酸检测阳性,满足以下两个条件中的一个:

1.同一份标本中新型冠状病毒2个靶标(ORF1ab、N)实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性的检测结果则需要重新采样重新检测。如果仍然为单靶标阳性判定为阳性。

2.两种标本实时荧光RT-PCR同时出现单靶标阳性或同种类型标本两次采样检测中均出现单个靶标阳性的检测结果可判定为阳性。

但是,不同生产企业的产品依据自身产品的性能选定的基因不同,确定的Ct阳性界值也不同,如果用的是商品化试剂盒,则以厂家提供的说明书为准。此外,阴性结果也不能排除新冠病毒感染,需要排除可能产生假阴性的因素,包括:样本质量差,比如口咽等部位的呼吸道样本;样本收集的过早或过晚;没有正确的保存、运输和处理样本;技术本身存在的原因,如病毒变异、PCR抑制等。

六、新冠核酸检测出现假阴性的原因?

目前大家所关注的核酸检测“假阴性”概念,往往是指核酸检测结果与临床表现不符的“假阴性”,即临床症状及影像学高度疑似新冠肺炎,但核酸检测多次或始终为“阴性”。根据国家卫健委临床检验中心给出的新冠病毒检测“假阴性”的解释如下。在被感染者中检出核酸,需同时满足以下四个条件,

1.被感染者的细胞中有一定量的病毒:现有数据显示机体被病毒感染后,病毒通过鼻腔和口腔进入到咽喉部,再到气管和支气管,进而到达肺泡,感染者会经历潜伏期、轻度症状、再到严重症状的过程,不同病程阶段以及机体不同部位存在的病毒量有所不同。从细胞种类的病毒载量看,肺泡上皮细胞(下呼吸道)>气道上皮细胞(上呼吸道)>成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞等;从标本类型来看,肺泡灌洗液(最优)>深咳痰>鼻咽拭子>口咽拭子>血液。此外,粪便也有报道能检出病毒。但是考虑操作的方便性和患者的接受程度,目前临床常用的标本顺序是口咽部拭子>鼻咽部拭子>支气管灌洗液(操作复杂)和深痰(常为干咳难得到)。因此在某些患者中,口咽部或鼻咽部细胞中病毒量较少或极低,如果只取口咽部或鼻咽部标本检测,病毒核酸就检测不到。

2.标本采集时要采集到含有病毒的细胞并有效保存病毒核酸:①采集部位不当,如采集口咽拭子时,采集深度不够;采集鼻咽拭子没有采到鼻腔深处等,可能采集到的细胞绝大部分都是不含病毒的细胞。②采样拭子使用错误,例如拭子头的材料推荐使用PE纤维、聚酯纤维、聚丙烯纤维等合成纤维,实际操作中使用了棉花等天然纤维(对蛋白质的吸附较强,不易洗脱)和尼龙类的纤维(吸水性不佳,导至采样量不足)。③病毒保存管使用错误,例如误用了易吸附核酸(DNA/RNA)的聚丙烯或聚乙烯塑料的保存管,导至保存液中核酸浓度下降。实际操作中推荐使用聚乙烯-丙烯聚合物塑胶与某些特殊处理的聚丙烯塑胶容器储存病毒核酸。上述环节操作不当均可能造成“假阴性”。

3.可靠的体外诊断试剂:部分厂家的试剂产品由于研发时间短,也没有使用已知临床样本进行必要的性能确认,可能存在对试剂优化不充分以及试剂批间差异大等问题。

4.规范的临床实验室:标本运输保存条件、临床实验室的规范操作、结果判读和质量控制等也是保证检测结果准确可靠的关键因素。

七、如何才能将新冠核酸检测“假阴性”的可能降到最低?

降低核酸检测假阴性应相对应地从产生假阴性的四个方面进行优化:

1.被感染者的细胞中有一定量的病毒:一个特定的疑似感染的患者,不同的病期,在不同的身体部位出现病毒的浓度会有差异,如咽部没有,却可能支气管灌洗液或粪便中有,如能同时或在疾病过程中的不同时间采取上述多种标本进行检测,会有助于“假阴性”的避免。

2.标本采集时要采集到含有病毒的细胞:通过加强对标本采集人员的培训,可以在很大程度上解决该问题。

3.可靠的体外诊断试剂:通过从国家层面开展试剂的检测性能评价研究,探讨存在的问题,可以进一步改进试剂质量,提高分析敏感性。

4.规范的临床实验室:通过加强对实验室人员的培训,不断完善实验室质量管理体系,保证合理的分区、有能力的检测人员和严格的质量管理体系,可以减少因实验室检测操作层面出现的“假阴性”。

八、为什么康复出院患者中再次出现新冠病毒核酸检测“阳性”?

新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版)》中明确规定,在新冠肺炎治愈出院的标准之一就是连续两次检测病毒核酸,若两次检测结果均为阴性,才具备出院指针,但近来有极少数出院患者中为什么再次出现新冠病毒核酸检测阳性?会不会再次感染?其原因是多样的。

1.新冠病毒是一个新病毒,它的致病机理、疾病全貌和病程特点还需要进一步加深认识,所以我们一方面要进一步加强对出院患者的管理,要进行14天的医学观察,同时观察当中应加强跟踪随访、健康监测和健康指导,同时对疾病的发生、发展、转归的全程进一步加深认识。

2.就病毒而言,患者有再次感染的可能。钟南山院士说:由于治愈的患者体内有抗体,因此新冠病毒再次入侵时可被抗体消灭,再次感染的几率不大,但“不大”并不代表“不会感染”,再次感染有多方面的原因,可能为康复患者自身的原因,也可能与病毒的改变有关,也可能为实验室检测的原因。如果是病毒自身的原因,新冠病毒变异可能导至康复患者自身产生的抗体对变异病毒无效,若患者再次被感染变异病毒,则核酸检测可能再次阳性。

3.就实验室检测方法而言,每一种检测方法都有其极限性。病毒核酸检测因因基因序列的选择,试剂的组成,方法的敏感程度等原因,导至现有的试剂盒均存在检测下限。当患者经过治疗后,体内病毒减少,待检样本中病毒载量低于检测下限时即会出现“阴性”结果,但此结果并不意味着体内病毒完全消失,病毒有可能在停止治疗后“死灰复燃”。因此,建议出院后2-4周各复查一次,以防漏网之鱼。

4.就核酸而言,核酸为病毒的遗传物质,患者经过抗病毒治疗病毒被杀灭,但残骸的病毒遗传物质RNA(核酸)片段仍然在人体内存留,并没有完全从体内排出体外,有时在特定的环境下,可以存留较长的时间,而在这时做核酸检测会出现“一过性”阳性。随着患者恢复时间进展,在体内残留的RNA片段逐渐排尽后,核酸可转为阴性结果。

5.就临床意义而言,新冠病毒的核酸检测,只是证明病毒RNA的存在与否,不能证明病毒活性以及病毒是否具有传播性。要证明核酸检测再次阳性的患者是否会再次成为传染源,要靠其临床标本进行病毒培养,培养出“活的”病毒存在才能证明其具有传染性。

综上所述,新冠病毒核酸检测与临床表现不符,如“假阴性”“康复后阳性”的情况无法完全避免,在实际筛查和检测中,建议应联合临床症状、影像学检查(CT)及实验室检查(核酸检查+病毒特异性抗体检测)进行综合诊断,以防漏诊误诊。如临床人员对检测结果感觉明显不符,建议对整个检测环节(如样本的采集、流转及处理等环节)进行综合分析,不排除新型冠状病毒早期感染、复发感染或合并其他呼吸道病毒感染等。如条件允许,建议采集痰液或肺泡灌洗液等敏感性更高的样本进行复测。




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