单靶标or多靶标:新冠检测试剂该如何选择?

2020-04-24 编辑: 来源:分子E讯
目前,国家药品监督管理局(NMPA)批准的新型冠状病毒检测试剂中,大部分采用的方法为实时荧光RT-PCR。它具有简便快速、特异性强、灵敏度高等特点。那么,其高灵敏度和高特异性的基础究竟是什么呢?让我们来一探究竟。

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试剂的检测性能如何体现?


检测性能评价中最主要的就是灵敏度与特异性。PCR扩增产物以指数方式增加,理论上2-3小时即可将1个靶分子DNA扩增至10亿个,因而具有很高的灵敏度。而影响特异性的因素通常有:引物的特异性、碱基配对的正确性以及靶标基因的特异性与保守性。


 
我们注意到,以上所提到的PCR试剂的灵敏度与特异性都离不开一个叫做“靶标基因”的东西。那什么是“靶标基因”呢?

靶标基因也叫目的基因,是PCR实验中所要研究的特定基因片段,检测试剂盒中的引物与荧光探针会与靶标基因发生特异性结合。就此次的新冠病毒而言,由于其与其他病毒如SARS/MERS等具有同源性,如果选择的靶标基因特异性不足,那么可能会导至假阳性结果。因此,选择正确且合适的病毒靶标进行引物与探针的设计格外重要,直接影响到试剂的检测性能。

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试剂的靶标基因如何选择?


结合以上内容我们可以看出,合适的靶标基因应具有强特异性和高保守性。

在病毒序列公布后,国家卫健委印发的最新版《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》,推荐选用针对新型冠状病毒的ORF1ab、N基因区域的引物和探针。
国际上以《加拿大安大略省公共卫生局(PHO)实验室的指导文件》为例,扩增靶基因包括RdRp基因(ORF1ab基因中的一段)和E基因。
另外以上两份文件都有说明,在实验室要确认一个病例为阳性,需用实时RT-PCR方法至少检测到病毒两个靶基因(国内添加了对于单个靶标阳性的判读,若复检仍为阳性则可判读为阳性)。

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靶标基因对检测性能的影响
比较分析《全国新型冠状病毒核酸检测室间质量评价结果报告》中的结果:

单靶标(ORF1ab)试剂仅一家,三靶标(ORF1ab、N与E)检测试剂两家,主要为双靶标(ORF1ab与N)检测试剂;

双靶标试剂检出了202010号检测限浓度(128 copies/mL)阳性样本,单靶标与三靶标试剂未能检出;

三靶标检测试剂的复检率相对更高;

各试剂对不同靶标基因的灵敏度存在差异,N区的阳性率高于ORF区,样本阳性越弱,这一现象越显著。

可以看出,就新冠检测试剂而言,设计同时针对两个靶标的引物和探针,可以最大程度的保证特异性并避免漏检的发生。但靶标基因数如果再多,反过来又会降低检测的灵敏度。

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影响试剂检测性能的其他因素


就PCR体系而言,不同厂家的检测试剂盒成分存在差异,引物、探针设计策略等因素都可能会对试剂盒灵敏度、特异性产生较大影响;其次,不同厂家的试剂研发能力参差不齐,若对PCR体系中各种影响因素的把控能力不够,则会极大程度地影响试剂盒的检测性能。另外,各实验室人员的操作能力存在差异,还是以本次新冠病毒检测的室间质评结果为例,即使是两家选取了两个相同靶标基因的试剂,在检出率和符合率指标上也会有较大差异,以上所说的因素都有可能造成这一结果。

总结

1.单靶标试剂对低病毒载量样本以及病毒突变株易造成漏检,三个及以上数量靶标由于PCR体系和结果判读都更为复杂,导至复检率高。说明靶标数量并非越多越好,而单靶标也存在明显不足,双检测靶标是更为平衡的选择。

2.靶标数量并非试剂检测性能的决定因素,靶标基因的选取、研发过程中对试剂的调试、对实验影响因素的把控都会造成各厂家试剂的检测性能参差不齐。对于试剂检测性能的评估不可局限于单一因素。



参考文献

1. 陈旭,齐凤坤,康立,实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用,东北农业大学学报,2010(41):148-155

2. 李金明《实时荧光PCR技术(第2版)》,科学出版社

3. 《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南(第5版)》

4. 《全国新型冠状病毒核酸检测室间质量评价结果报告》

5. 《Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR》

6. 《加拿大安大略省公共卫生局(PHO)实验室的指导文件》

7. Jaqueline Goes de Jesus, Claudio Sacchi, Ingra Claro. First report of COVID-19 in South America.

http://virological.org/t/first-report-of-covid-19-in-south-america/409

8. Xiaolu Tang, Changcheng Wu, Xiang Li. On the origin and continuing evolution of SARS-CoV-2. National Science Review, nwaa036.

https://doi.org/10.1093/nsr/nwaa036

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