探秘 | 新冠病毒转录机制与核酸检测靶标设计

2020-05-05 编辑: 来源:分子E讯
2020年3月11日,世界卫生组织宣布2019新冠病毒疫情已构成全球大流行,疫情在全球广泛传播。目前虽然我国针对此次疫情的全民防控取得了很好成效,但全球新冠肺炎确诊已超340万例,世卫组织警告“大流行远未结束”[1]。因此在临床治疗措施外更不能忽视基础研究,战胜此次人类新冠病毒疫情还要靠科研推进,当前弄清楚新冠病毒的独特致病机制尤为重要,能够更好的指导病毒检测和疫苗药物研发。

随着临床与基础科研的开展,我们对新冠病毒的理解加深,早期人们通过临床分离获得病毒,研究其理化性状指导检测和消毒;对病毒基因组序列测定并进行生物信息学分析研究其遗传进化规律指导流行病学调研;病毒的一大特性就是不断变异,这对指导防控和研发疫苗意义重大,近期我们对病毒临床突变株研究进行了解读,参见分子E讯[2]:文献解读 | 新冠病毒突变株的感染致病性临床研究;突变在病毒基因组水平的发生机制目前尚未明确,但与病毒基因组复制转录等密切相关,因此本文对相关的最新研究进行进一步解读,以加深对病毒致病机制的理解。

冠状病毒为不分节段的单股正链RNA病毒,携带所有RNA病毒家族中最大的基因组(约30kb)。新冠病毒主要由结构蛋白和非结构蛋白组成,结构蛋白包括刺突蛋白(Spike Protein,S)、包膜蛋白(Envelope Protein,E)、膜蛋白(Membrane Protein,M)、核衣壳蛋白(Nucleoprotein,N)。非结构蛋白包括蛋白酶(Protease)PLPro及3CLpro、解旋酶(Helicase)、RNA聚合酶(RNA Polymerase)。结构蛋白S是病毒与细胞受体结合入侵过程中的关键,非结构蛋白则是新冠病毒生命周期过程中的关键酶。病毒基因组两端是5'和3'非编码区,5'-端有帽子结构,3'-端聚腺苷酸化,非编码区含有茎-环结构等特殊元件和保守二级结构,在病毒的复制和转录过程中发挥着重要的调控作用[3]。

病毒基因组被用作复制和转录的模板,病毒正链RNA进入宿主细胞后,一方面作为 mRNA指导转录蛋白合成;一方面通过自身编码的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)作用生成负链RNA,再以其为模板生成正链基因组RNA (positive-sense genomic RNA, gRNA)完成复制。gRNA由结构蛋白包装后组装子代病毒。病毒基因组RNA作为转录体将两个开放读码框ORF1a和ORF1b分别翻译合成pp1a和pp1ab蛋白,裂解后形成非结构蛋白。ORF1a产生多肽1a(pp1a),ORF1a末端附近有一个滑动序列和一个RNA假结,可使核糖体执行-1移码,从而在ORF1b上继续翻译产生更长的多肽1ab(pp1ab)。pp1a和pp1ab自动蛋白水解,产生十多种具有各种功能的非结构蛋白(nsps, nonstructural proteins)。其中,nsp12具有RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)活性,而nsp3和nsp5分别具有木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLPro)和主蛋白酶(Mpro或3CLpro)活性。冠状病毒的一个重要特点是其独特的转录策略,新冠病毒基因组RNA还以负链RNA为模板进一步合成亚基因组RNA (subgenomic RNA, sgRNA)。通过不连续转录合成一组嵌套的病毒亚基因组RNA使病毒基因组3'端基因得以表达,用于合成病毒所需的各种蛋白。sgRNA编码保守的结构蛋白(刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N))和6个分别由ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF10编码的辅助蛋白(3a,6、7a,7b,8和10)[3]。冠状病毒亚基因组RNA的分析和鉴定有助于全面地认识病毒RNA与宿主RNA间的相互作用,为阐明病毒的致病机制奠定基础。

 
2020年4月23日,韩国基础科学研究所RNA研究中心、国立首尔大学生物科学院、韩国疾控中心、国立健康研究所团队在顶级科研期刊《细胞》(Cell)在线发表研究文章[4]:The architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome(新冠病毒转录组架构)。该研究主要涉及病毒亚基因组转录体与RNA修饰的结构和功能研究,不仅对新冠病毒的转录组体系结构进行了详细分析,还发现了新的病毒RNA和未知的病毒RNA化学修饰。论文结果有助于理解新冠病毒复制机理及其如何逃避机体免疫防御系统,为研究病毒的生命周期和致病机理提供了重要信息。
深度测序技术是研究病毒转录组的主要工具,DNA纳米球测序(DNA nanoball sequencing)只能读取短片段,但具有高精度分析大量序列的优势,纳米孔直接RNA测序(nanopore direct RNA sequencing)可直接分析整个长病毒RNA,两种技术在分析病毒RNA方面具有很好的互补性。《细胞》杂志的这篇研究论文中,研究人员结合了两种测序技术来分析亚基因组RNA(sgRNA)、开放读码框(ORF)和转录调控序列(TRS),对新冠病毒转录组和表观转录组进行了详细研究,绘制了新冠病毒转录组和表位转录组的高分辨率图谱,揭示了一系列RNA修饰的经典与非经典病毒转录。结果提示新冠病毒转录体含有大量亚基因组RNA,尤其N基因普遍存在于各亚基因组中,而表观转录组研究发现N基因所在区域也是病毒基因发生化学修饰的主要部位。以下是论文阐述总结的要点发现:

1. 提供了新冠病毒转录组和表观转录组高分辨率基因图谱;

2. 由于大量不连续转录事件使转录组高度复杂;

3. 除了10个经典RNA(基因组与9个亚基因组RNA),通过融合、缺失、移码还产生了编码未知开放读码框RNA转录体;

4. 在转录体上发现至少41个具有AAGAA基序的RNA潜在修饰位点。
首先,研究人员使用新冠病毒感染的Vero细胞中提取的总RNA进行了转录组研究,分析了每个亚基因组RNA的序列信息,并揭示了病毒基因在基因组RNA上的准确位置。在被感染的Vero细胞中,超过65.4%和68.8%的mRNA转录体由病毒RNA构成,说明新冠病毒对宿主细胞的转录具有明显抑制作用。基因组预测已知冠状病毒通常有10个亚基因组RNA结构可翻译成病毒蛋白,但研究人员仅证实了其中9个亚基因组RNA,另一个亚基因组RNA ORF10的转录体未被检测到。由于OFR10与已知蛋白均不具同源性,且不存在于其他冠状病毒中,故ORF10很有可能并不表达。由于RNA融合和缺失等因素影响,存在数十种未知的亚基因组RNA,推测这可能与新冠病毒的快速变异和进化有关。以上转录组研究结果表明新冠病毒具有冠状病毒的共同转录特征,主要产生多个亚基因组RNA,这些亚基因组RNA均含有不同长度的病毒基因组RNA和3'末端非编码区序列。

其次,在表观转录组研究中发现,新冠病毒RNA有多种未知的化学修饰,这些 RNA修饰主要集中于基因组28,500-29,500位置,此处恰为N基因所在位置(参见参考序列[5]:NCBI Reference Sequence: NC_045512.2)。在41处潜在的RNA修饰位点最多见的基序是AAGAA。全长的病毒RNA Poly(A)尾比sgRNA的Poly(A)尾更长,修饰的病毒RNA poly(A)尾比未修饰的更短,长病毒转录体RNA修饰比短病毒转录体更为频繁,表明RNA修饰和3'末端poly(A)尾之间存在关联,可能有特定RNA种类的修饰机制。尽管这些变体RNA在碱基序列方面具有相同的遗传信息,但其可能被赋予了新的未知特性,推测RNA修饰可能为病毒逃避宿主免疫攻击的一种机制。以上表观转录组研究结果表明新冠病毒RNA在病毒进化中发生较多化学修饰,且主要集中于N基因区域,该现象可能与病毒基因突变机制一起阻碍宿主的免疫识别。

在近期对新冠病毒突变株感染致病性临床研究的解读[2]中,我们指出病毒基因组序列突变可能对病毒核酸检测存在潜在影响,而本文献中通过对亚基因组的研究,我们发现其他可能影响核酸检测的因素:如对病毒RNA的修饰可能隐蔽或破坏检测部位区域的序列构象特征,这些数据结果表明基因组水平的突变或修饰对核酸检测具有重要影响,值得监测研究。从新冠病毒的转录组研究结果可知,由于ORF1ab由全长基因组转录翻译,而N基因还可通过亚基因组转录翻译,故N基因转录量高于ORF1ab,针对ORF1ab基因区域的阳性检测几率低于N基因区域。所以,在新冠病毒核酸检测中N基因作为检测靶标是有必要的,能够提高检测的灵敏度。而且,对表观转录组的研究显示N基因区域含有较多病毒化学修饰位点,因此在N基因保守区合理设计的引物结合测序能够很好的检测到修饰或突变的病毒核酸,包含N基因的多靶标检测方案更为合理,能够提高检测准确性[6]。

参考文献:

1. 人民日报海外网(2020年5月3日). https://baijiahao.baidu.com/s?id=1665610985727611979&wfr=spider&for=pc

2. 分子E讯(2020-5-2):新冠病毒突变株的感染致病性临床研究

3. Brian DA, Baric RS. Coronavirus genome structure and replication. Curr Top Microbiol Immunol. 2005;287:1‐30. doi:10.1007/3-540-26765-4_1

4. Dongwan Kim, Joo-Yeon Lee, Jeong-Sun Yang, Jun Won Kim, V. Narry Kim, Hyeshik Chang,The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome. Cell. 2020. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.04.011.

5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_045512.2

6. 分子E讯(2020-4-22):单靶标or多靶标:新冠检测试剂该如何选择?

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