核酸定量内标与外标,你知道多少?

2020-06-30 编辑: 来源:分子E讯
众所周知,在实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)中模板的浓度对数值与结果Ct值呈线性关系,Ct值越小,浓度越高。根据所选取定量数学模型的差别,主要有外标定量法(外标法)和内标定量法(内标法)两种定量方法。这些数学模型就像特殊标记的尺子,把得到的Ct值测量为浓度值。

外标法:即绝对定量,是使用一系列稀释的已知浓度标准品与临床标本同时进行测定,求出标准品的Ct值与起始模板浓度之间的线性比例关系。通过待测标本的Ct值就可以在线性关系中求出其原始的模板浓度。

内标法:是指将标准内标与待测样本在同一管内扩增,然后通过内标的量来推导待测模板的量,是一种相对定量的数学模型。该模型是假定了临床样本和内标有一致的扩增效率。[1]

Q 内标法需要检测标准品吗?

A 需要。要实现对样本的定量检测,必然需要使用到已知浓度的标准品,就像天平称量离不开砝码一样。内标法就像是用了一个苹果充当砝码,但这个苹果最初肯定得使用砝码称量一遍。

与外标法直接比较待测样本和标准品不一样,内标法使用靶基因Ct值和内标Ct值的差值进行运算。多一个维度的参数,使得该方法更为准确,但也使得运算更为复杂。该差值与靶基因起始模板量之间呈二次函数关系,所以需要测定更多的标准品(6个以上)才能保证这个二次函数的准确性。

因此,内标法不但需要检测标准品,而且还需要检测更多的标准品。


Q 如何不带标准品使用内标法?

A 不带标准品的内标法=调用标准曲线的外标法;由于成本的考虑,使用内标法的厂家大都未使用标准品。所以在检测过程中,这些厂家便采用调取出厂标准曲线函数的方式。部分实验室在使用外标法时也会用到这个方法,但这种方式往往是极不被推荐的。因为如果不能排除不同仪器、不同批试剂、不同实验环境(温度湿度)、不同实验操作等因素造成的影响,那么结果的准确性就很难得到保证。

因而,无论是内标法还是外标法,如希望不带标准品进行检测,应尽量避免上述风险,所以只能选择全封闭系统,并对使用环境做较为严苛的要求。

Q 内标法可以彻底解决样本间差异对定量结果的影响么?

A 不能。不同的标本存在个体化差异,除靶序列的变异外,对PCR定量结果存在影响的还有多种因素。面对不同的干扰因素,两种方法各有优劣。

注:“-”没有影响;“+”有一定影响;“++”有较大影响;

小结

内标法和外标法作为两种不同的PCR定量方法模型,有各自的特点,并无本质的优劣势之分。作为一项检测技术,以提供科学、客观、准确的检测结果为目的,为临床医生诊断和治疗提供参考价值,充分体现检测的临床意义才是最重要的。


参考文献:

[1]李金明.《实时荧光PCR》[M].(第2版).科学出版社,2016年:83-93.

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