新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第三版)

2020-02-05 编辑: 来源:国家卫健委
为指导各级疾控部门和其他相关机构开展新型冠状病毒感 染的肺炎实验室检测工作,特制定本技术指南。本指南主要介绍目前已经比较成熟、易于实施的核酸检测方法。

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标本采集

1、采集对象。

新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者, 其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者,或其他需 要进一步筛查检测的环境或生物材料(如溯源分析)。

2、标本采集要求。

(1)从事新型冠状病毒检测标本采集的技术人员应经过生物 安全培训(培训合格)和具备相应的实验技能。

采样人员个人防护装备(personal protective equipment,PPE)要求:N95 及以上防护口罩、护目镜、连体防护服、双层乳胶手套、防水 靴套;如果接触了患者血液、体液、分泌物或排泄物,应及时 更换外层乳胶手套。

(2)住院病例的标本由所在医院的医护人员采集。

(3)密切接触者标本由当地指定的疾控机构、医疗机构负责 采集。

(4)根据实验室检测工作的需要,可结合病程多次采样。

3、标本采集种类。

每个病例必须采集急性期呼吸道标本(包括上呼吸道标本 和下呼吸道标本);重症病例优先采集下呼吸道标本(如支气管 或肺泡灌洗液等);出现眼部感染症状的病例,需采集眼结膜拭 子标本;出现腹泻症状的病例,需留取便标本。可根据临床表 现与采样时间间隔进行采集。

其他研究材料依据设计需求采集。标本种类:

(1)上呼吸道标本:包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物等。

(2)下呼吸道标本:包括深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管 灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本。

(3)血液标本:尽量釆集发病后7天内的急性期抗凝血。采 集量5ml,以空腹血为佳,建议使用含有EDTA抗凝剂的真空釆血 管采集血液。

(4)血清标本:尽量釆集急性期、恢复期双份血清。第一份 血清应尽早(最好在发病后7天内)釆集,第二份血清应在发病 后第3~4周釆集。采集量5ml,建议使用无抗凝剂的真空釆血管。血清标本主要用于抗体的测定,从血清抗体水平对病例的感染 状况进行确认。血清标本不进行核酸检测。

(5)眼结膜标本:出现眼部感染症状的病例需采集眼结膜拭 子标本。

(6)便标本:出现腹泻症状的患者需采集便标本。

4、标本采集方法。

(1)咽拭子:用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双 侧咽扁桃体及咽后壁,将拭子头浸入含3ml病毒保存液(也可使 用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液)的管中,尾部弃 去,旋紧管盖。

(2)鼻拭子:将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻 道内鼻腭处,停留片刻后缓慢转动退出。取另一根聚丙烯纤维 头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。上述两根拭子 浸入同一含3ml采样液的管中,尾部弃去,旋紧管盖。

(3)鼻咽抽取物或呼吸道抽取物:用与负压泵相连的收集器 从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。将收集器头部 插入鼻腔或气管,接通负压,旋转收集器头部并缓慢退出,收 集抽取的粘液,并用3ml采样液冲洗收集器1次(亦可用小儿导 尿管接在50ml注射器上来替代收集器)。

(4)深咳痰液:要求病人深咳后,将咳出的痰液收集于含3ml 采样液的50ml螺口塑料管中。

(5)支气管灌洗液:将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入 气管(约30cm深处),注入5ml生理盐水,接通负压,旋转收集 器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液,并用采样液冲洗收集器1次(亦可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集)。

(6)肺泡灌洗液:局部麻醉后将纤维支气管镜通过口或鼻经

过咽部插入右肺中叶或左肺舌段的支管,将其顶端契入支气管 分支开口,经气管活检孔缓缓加入灭菌生理盐水,每次30~50 ml,总量100~250ml,不应超过300ml。

(7)血液标本:建议使用含有EDTA抗凝剂的真空釆血管采集 血液标本5ml,室温静置30分钟,1500~2000rpm离心10分钟, 分别收集血浆和血液中细胞于无菌螺口塑料管中。

(8)血清标本:用真空负压采血管采集血液标本5ml,室温静 置30分钟,1500~2000rpm离心10分钟,收集血清于无菌螺口塑 料管中。

(9)粪便标本:如患者发病早期出现腹泻症状,则留取粪便 标本3-5ml;

(10)眼结膜拭子标本:眼结膜表面用拭子轻轻擦拭后,将 拭子头进入采样管中,尾部弃去,悬紧管盖。

其他材料:依据设计需求规范采集。

5、标本包装。

标本采集后在生物安全二级实验室生物安全柜内分装。

(1)所有标本应放在大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的样本采集管里,拧紧。容器外注明样本编号、种类、姓名及 采样日期。

(2)将密闭后的标本放入大小合适的塑料袋内密封,每袋装一份标本。样本包装要求要符合《危险品航空安全运输技术细 则》相应的标准。

(3)涉及外部标本运输的,应根据标本类型,按照A类或B类 感染性物质进行三层包装。

6、标本保存。

用于病毒分离和核酸检测的标本应尽快进行检测,能在24 小时内检测的标本可置于4℃保存;24小时内无法检测的标本则 应置于-70℃或以下保存(如无-70℃保存条件,则于-20℃冰箱 暂存)。血清可在4℃存放3天,-20℃以下可长期保存。应设立 专库或专柜单独保存标本。标本运送期间应避免反复冻融。

7、标本送检。

标本采集后应尽快送往实验室,如果需要长途运输标本, 建议采用干冰等制冷方式进行保藏。

(1)上送标本。

各省(自治区、直辖市)聚集性病例的标本,上送中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所进行检测复核,并附样本送检单。
(2)病原体及标本运输。

a.国内运输。新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性生物材料的运输包装分类属于A类,对应的联合国编号为UN2814,包装符合国际民航 组织文件Doc9284《危险品航空安全运输技术细则》的PI602分类包装要求;环境样本属于B类,对应的联合国编号为UN3373, 包装符合国际民航组织文件Doc9284《危险品航空安全运输技术 细则》的PI650分类包装要求;通过其他交通工具运输的可参照 以上标准包装。

新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性材料运输应按照《可 感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规 定》(原卫生部令第45号)办理《准运证书》。

b.国际运输。新型冠状病毒毒株或样本在国际间运输的,应规范包装,按照《出入境特殊物品卫生检疫管理规定》办理相关手续,并 满足相关国家和国际相关要求。

c.毒株和样本管理。新型冠状病毒毒株及其样本应由专人管理,准确记录毒株和样本的来源、种类、数量,编号登记,采取有效措施确保毒 株和样本的安全,严防发生无用、恶意使用、被盗、被抢、丢 失、泄露等事件。

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新型冠状病毒的实验室检测

新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光RT-PCR 鉴定。任何新型冠状病毒的检测都必须在具备适当条件的实验 室由经过相关技术安全培训的人员进行操作。本指南中的核酸 检测方法主要针对新型冠状病毒基因组中开放读码框1ab(open reading frame 1ab , ORF1ab ) 和 核 壳 蛋 白 ( nucleocapsid protein,N)。

在实验室要确认一个病例为阳性,满足以下条件:同一份标本中新型冠状病毒2个靶标(ORF1ab、N)特异性实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性的 检测结果,则需要重新采样,重新检测。

阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染,需要排除可能产生假阴性的因素,包括:样本质量差,比如口咽等部位的呼吸 道样本;样本收集的过早或过晚;没有正确的保存、运输和处 理样本;技术本身存在的原因,如病毒变异、PCR抑制等。

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实时荧光 RT-PCR 检测方法

1、目的。

规范实时荧光RT-PCR方法检测新型冠状病毒核酸的工作程 序,保证实验结果的正确可靠。

2、范围。

适用于实时荧光RT-PCR方法检测新型冠状病毒核酸。

3、职责。

检测人员:负责按照本检测细则对被检样本进行检测。复核人员:负责对检测操作是否规范以及检测结果是否准确进行复核。

部门负责人:负责对科室综合管理和检测报告的审核。

4、样本接收和准备。

核对被检样本姓名、性别、年龄、编号及检测项目等;待检样本的状态如有异常,需注明;待检样本应存放于-70℃冰箱 保存。

5、检测项目。

(1)新型冠状病毒核酸测定(实时荧光RT-PCR方法) 推荐选用针对新型冠状病毒的ORF1ab、N基因区域的引物和探针。

靶标一(ORF1ab): 正向引物(F):CCCTGTGGGTTTTACACTTAA;反向引物(R):ACGATTGTGCATCAGCTGA

荧光探针(P):5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'

靶标二(N): 正向引物(F):GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT;反向引物(R):CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

荧光探针(P):5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'

核酸提取和实时荧光RT-PCR反应体系及反应条件参考相关 厂家试剂盒说明。

(2)结果判断 阴性:无Ct值或Ct≥40。阳性:Ct值<37,可报告为阳性。

灰度区:Ct值在37-40之间,建议重复实验,若重做结果Ct 值<40,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性。

注:如果用的是商品化试剂盒,则以厂家提供的说明书为准。

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病原生物安全实验活动要求

根据目前掌握的新型冠状病毒的生物学特点、流行病学特征、临床资料等信息,该病原体暂按照病原微生物危害程度分 类中第二类病原微生物进行管理,具体要求如下:

1、病毒培养。

病毒培养是指病毒的分离、培养、滴定、中和试验、活病 毒及其蛋白纯化、病毒冻干以及产生活病毒的重组实验等操作。上述操作应当在生物安全三级实验室的生物安全柜内进行。使 用病毒培养物提取核酸,裂解剂或灭活剂的加入必须在与病毒 培养等同级别的实验室和防护条件下进行,裂解剂或灭活剂加 入后可比照未经培养的感染性材料的防护等级进行操作。实验 室开展相关活动前,应当报经国家卫生健康委批准,取得开展 相应活动的资质。

2、动物感染实验。

动物感染实验是指以活病毒感染动物、感染动物取样、感 染性样本处理和检测、感染动物特殊检查、感染动物排泄物处 理等实验操作,应当在生物安全三级实验室的生物安全柜内操 作。实验室开展相关活动前,应当报经国家卫生健康委批准, 取得开展相应活动的资质。

3、未经培养的感染性材料的操作。

未经培养的感染性材料的操作是指未经培养的感染性材料 在采用可靠的方法灭活前进行的病毒抗原检测、血清学检测、 核酸提取、生化分析,以及临床样本的灭活等操作,应当在生 物安全二级实验室进行,同时采用生物安全三级实验室的个人 防护。

4、灭活材料的操作。

感染性材料或活病毒在采用可靠的方法灭活后进行的核酸 检测、抗原检测、血清学检测、生化分析等操作应当在生物安 全二级实验室进行。分子克隆等不含致病性活病毒的其他操作, 可以在生物安全一级实验室进行。




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